Оренбургский государственный университет

Моделирование фагоцитоза

Впервые продемонстрированы различия в спектрах световой эмиссии, формирующейся при бактериальной биолюминесценции и люминолзависимой хемилюминесценции. В качестве источников свечения при изучении биолюминесценции использовались рекомбинантные штаммы Escherichia coli с клонированными lux-оперонами почвенной люминесцирующей бактерии Photorhabdus luminescence, морской люминесцирующей бактерии Photobacterium leiognathii, а также бесклеточная ферментная система генерации свечения P.leiognathii с соответствующими субстратами. Изучение спектров свечения люминола проводилось в бесклеточной системе "перекись водорода - пероксидаза" и в фагоцитарной системе: на примере нейтрофилов периферической крови человека, стимулированных C3b-зимозаном.

Полученные результаты свидетельствуют о возможности одновременной раздельной оценки люминолзависимой хемилюминесценции, формируемой в результате активации фагоцитов, и биолюминесценции бактериальных клеток-мишеней в одной анализируемой пробе. При этом учет интенсивности хемилюминесценции возможен в диапазоне <420 нм, а биолюминесценции - в диапазоне >560 нм, что может быть реализовано с использованием соответствующих отсекающих светофильтров.

Возможность другого подхода к раздельной оценке люминолзависимой хемилюминесценции фагоцитов и биолюминесценции бактериальных клеток-мишеней основана на обнаруженной возможности термоинактивации клонированной в E.coli ферментной системы генерации свечения P.leiognathi без изменения жизнеспособности реципиентных бактериальных клеток. При этом в исследованном интервале температур это невозможно для другого генноинженерного штамма E.coli, содержащего ферментную систему генерации свечения почвенного люминесцирующего микроорганизма P.luminescence, что указывает на возможность осуществления способа только с использованием рекомбинантных штаммов с определенной генетической характеристикой.

При разработке систем генерации активных метаболитов кислорода, идентичных образующимся при фагоцитозе, определены оптимальные условия генерации пероксинитрита и проведена апробация данной окислительной системы по ее бактерицидности в отношении Escherichia coli и Staphylococcus aureus. Экспериментальное обоснование пригодности отобранных систем генерации активных метаболитов кислорода для моделирования фагоцитоза расширено за счет изучения бактерицидных эффектов в отношении Enterococcus faecalis. При исследовании бактерицидности систем генерации супероксиданиона, оксида азота и пероксинитрита определены оптимальные условия выявления бактерицидных эффектов по параметрам экспозиции, концентрации бактериальных клеток, выраженности эффекта и вариабельности (воспроизводимости) получаемых результатов.

Для проведения исследований и дальнейшей разработки способа биохемилюминесцентной оценки фагоцитоза в режиме реального времени предложена оригинальная конструкция двухканального биохемилюминесцентного анализатора "БиЛюм", новизна которого защищена двумя патентами РФ на полезную модель. Первое из реализованных при его создании технических решений предусматривает использование двух независимых фотоэлектронных умножителей (ФЭУ). При этом кюветное отделение подобного устройства снабжено центрально расположенной темновой камерой для размещения анализируемой пробы, имеющей два боковых окна с соосными им цилиндрическими выточками для крепления ФЭУ. В свою очередь на оптическом пути от анализируемой пробы к каждому из ФЭУ в структурной связи с боковыми окнами кюветного отделения находятся перпендикулярно расположенные по отношению к ним щели, позволяющие размещать в них регистрирующие полосовые или отсекающие интерференционные светофильтры.

Другое техническое решение заключается в использовании кюветного отделения, обеспечивающего идентичный режим их термостатирования, но содержащего две отдельные темновые камеры, каждая из которых оказывается сопряжена с отдельным регистратором со своей системой регистрации импульсов, сигнал с которой передается на единую схему сопряжения, позволяющую ввести данные в ПК с последующим расчетом абсолютной и относительной разницы интенсивности свечения в сравниваемых пробах.

Результаты работы в 2006 году